三級甲等綜合醫(yī)院國營
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化驗取材:血液
抗丁型肝炎病毒IgM抗體的測定原理:根據(jù)免疫學(xué)中抗原,抗體之間的特異性結(jié)合的原理,利用抗人免疫球蛋白IgM捕捉待檢血清中的IgM,然后加入丁型肝炎病毒抗原(HDAg)使之與血清中IgM抗HDV抗體結(jié)合,然后利用酶標(biāo)記的抗-HDVIgG,它即具有與HDAg相互反應(yīng)的免疫學(xué)特異性,又具有酶的催化,放大活性。當(dāng)加入相應(yīng)底物后,酶使底物氧化(HRP)或水解(AKP)從而使無色底物變?yōu)橛猩@妙伾纳顪\或A值的高低確定IgM抗HDV抗體的有無和含量的高低。
試劑:
(1)聚苯乙烯塑料板:40孔或96孔板,進口或國產(chǎn)。
(2)可變微量加樣器:20μl,100μ1各1支。
(3)抗人IgM(μ鏈):鼠抗人IgM單克隆抗體或兔(羊)抗人IgM多克隆抗體。
(4)IgM抗HD陰性,陽性對照血清。
(5)HDAg:大腸桿菌表達(dá)的基因工程抗原粗提液。ELISA滴度:1∶640~1∶1280。
(6)HPR-抗HDVIgG:應(yīng)用改進的過碘酸鈉法標(biāo)記抗HDVlgG多克隆抗體,使用稀釋度1∶400~1∶4000(于10%小牛血清的PBS液中)。
(7)包被液:0.05mol/LpH9.5~9.6的碳酸鹽緩沖液(Na2CO315.9g,NaHCO329.3g加水到1000ML,1∶10稀釋使用)。
(8)洗液:0.01mol/LpH7.2~7.4PBST(內(nèi)含8.5G/LNaCL,0.5‰Tween20)。
(9)稀釋液:0.01mol/LpH7.2~7.4PBS。用于稀釋和標(biāo)記抗體。
(10)底物液:用前新配制。4mg鄰苯二胺(OPD)+10ml基質(zhì)液(pH5.0磷酸,檸檬酸緩沖液,即Na2HPO418.4g、檸檬酸5.1g溶于1000ml離子水中4℃保存?zhèn)溆茫┐芑蠹?%H2O250μl混合均勻后立即使用。
(11)終止劑:2mol/LH2SO4。
操作方法:
(1)用0.05mol/LpH9.5~9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋抗人IgM單克隆抗體,包被聚苯乙烯板,每孔100μl,放4℃過夜。
(2)用PBST洗3次(中間不停留)拍干。
(3)每孔分別加入100μl1∶1000稀釋后的待檢血清和陰、陽性對照血清(陰性對照3孔,陽性對照2孔)放37℃1h。
(4)負(fù)壓下用PBST洗板3次(方法同上)抽干(將血清和廢液抽到消毒瓶內(nèi)防止污染環(huán)境)。
(5)每孔加入50~100μl經(jīng)適當(dāng)稀釋后的HDAg(2~4個ELISA單位)放45℃1h。
(6)洗3次后,每孔加入50μlHRP-抗-HDVIgG抗體(于含1%小牛血清的PBS中)放42~45℃1h。
(7)洗3次后,加50μl新鮮配制的底物液,放室溫暗處顯色15~30min,當(dāng)陽性對照顯黃色后,每孔加入1滴(25μl)2mol/LH2SO4終止反應(yīng)。
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