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(1)胰島素碘標記物制備和純化:
①取Na125I3.7×107Bq置于含胰島素2μg(20μl)的反應(yīng)管內(nèi)。
②加氯胺T溶液10μl。
③立即蓋緊,輕敲小管使試劑快速混和。
④12~15s后,加偏焦亞硫酸鈉溶液25μl(62.5μg)。
⑤把管內(nèi)容物加至SephadexG-50柱上,用測定緩沖液洗滌,每管0.5ml收集45管,再用γ計數(shù)器計數(shù)。第一峰為125I標記的活性胰島素,第二峰是沒有結(jié)合的放射性碘。
(2)標記激素的免疫反應(yīng)性估價:取第一峰收集物,以測定緩沖液稀釋至5000cpm/0.1ml,取0.1ml該標記物于小試管中,加入過量抗血清(0.1ml)及0.1ml測定緩沖液,在4℃溫育24h,然后加1ml葡聚糖活性炭懸浮液,在適當攪拌后,試管在4℃靜止15min,然后再離心15min,丟棄上清液,計數(shù)沉淀,沉淀計數(shù)應(yīng)少于加入量的5%,如計數(shù)增加,指示125I-胰島素破壞。
(3)抗血清滴定:將抗血清系列稀釋,從1∶320000至1∶10000測定時,在小試管中加0.1ml測定緩沖液,0.1ml稀釋的抗血清,0.1ml稀釋的標記胰島素。在4℃溫育20h,然后加1ml葡聚糖活性炭,適當攪拌后,在4℃溫育15min后,再離心15min。丟棄上清液,測量沉淀物放射性計數(shù),計數(shù)以加入量(F/T%)的35%~60%為合適的抗體稀釋度。
(4)胰島素測定:標準管與測定管做雙份,具體操作如下表(表1):
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