診斷先天性巨結腸，主要根據臨床表現，確診則需要X線鋇劑灌腸、直腸肛管測壓、直腸活檢、組織化學等客觀檢查方法。
先天性巨結腸病兒，在新生兒期因出現急性腸梗阻癥，開腹探查屢見不鮮;在年長兒期，誤將糞石當腫瘤開腹也時有發生;也常因癥狀不典型而延誤診斷和治療。誤診、誤治原因，主要是病史不清，查體不細，其次才是缺乏對先天性巨結腸的了解和認識。先天性巨結腸須與下列病癥相鑒別。
1.新生兒期
(1)先天性肛門直腸畸形：該癥為最常見的低位腸梗阻原因。肛門閉鎖或僅有瘺孔時，經仔細望診就可辨認這類異常肛門，但肛門正常的直腸狹窄或閉鎖，還需經肛診及X線檢查證實。
(2)先天性腸閉鎖或狹窄：低位的腸閉鎖或狹窄也為低位腸梗阻表現，肛診后沒有胎便或僅有少量灰白色膠凍樣便(腸狹窄可有少量胎便)。X線鋇劑灌腸顯示病變遠端結腸異常細小(胎兒型結腸)，鋇劑不能通過病變部位(閉鎖)或者很難通過(狹窄)病變部位。
(3)功能性腸梗阻：功能性腸梗阻常見于早產兒，Nixon等(1968)對這類病兒經直腸肛管測壓檢查，證明缺乏正常反射，認為與肌間神經節細胞不成熟有關。其他疾病也可引起新生兒功能性腸梗阻，諸如呼吸困難、感染中毒、腦組織損傷等。
(4)壞死性小腸結腸炎：新生兒的壞死性小腸結腸炎，多與生后窒息、乏氧、休克等原因有關。除沒有生后便秘史外，臨床癥狀常不易與新生兒巨結腸腸炎鑒別。
(5)胎糞性腹膜炎：胎糞性腹膜炎與胎兒期腸穿孔有關。出生前穿孔未閉合者，生后因腸內容物進入腹腔而發生穿孔性腹膜炎;出生前穿孔已愈合者，無菌的胎便進入腹腔后，引起胎糞性腹膜炎，致小腸廣泛粘連及胎便鈣化，可發生粘連性腸梗阻。
(6)單純性胎糞便秘：單純性胎糞便秘也稱胎糞塞綜合征，主要因胎便黏稠，致一過性胎便排出障礙，致腸梗阻。這類病兒均為足月新生兒，生后24～48h仍不能自動排泄，出現低位腸梗阻癥狀。該癥經肛診或洗腸等方法排便后，癥狀緩解且不再復發。
(7)胎糞性腸梗阻：胎糞性腸梗阻在我國很少見。該病與胰腺的纖維囊性病有關，是西方國家新生兒低位腸梗阻的常見原因之一，發病率約1/2000。該癥中10%～15%病兒因胎便過度黏稠，堵塞回腸遠端而發病。
(8)新生兒腹膜炎：也分原發性腹膜炎和續發性腹膜炎。新生兒原發性腹膜炎少見，多為臍源性感染，有的為血源性，與敗血癥有關。續發性腹膜炎見于新生兒巨結腸穿孔、胃穿、膽道穿孔及闌尾炎等。
2.乳幼兒和兒童期
(1)續發性巨結腸：也稱器質性巨結腸。巨結腸續發于器質性病變或機械性不全梗阻，與長期排便不暢或受阻有關。常見于先天性肛門直腸狹窄、直腸外腫物壓迫、肛門直腸畸形術后或外傷后形成的肛門瘢痕狹窄。經肛門檢查可以確診。
(2)特發性巨結腸：該癥與排便訓練不當有關，特點是無新生兒期便秘史，2～3歲時發病或出現明顯癥狀;慢性便秘常伴肛門污便，便前常有腹痛;肛診感覺除直腸擴張積便外，括約肌處于緊張狀況。直腸肛管測壓有正常反射，是診斷該病和除外先天性巨結腸的最可靠方法。
(3)先天性巨結腸同源病。
(4)先天性乙狀結腸過長：因乙狀結腸過長而大量貯存糞便致慢性便秘，常伴乙狀結腸擴張。
(5)退化性平滑肌病：其癥狀為便秘，慢性進行性腹脹和腸梗阻。除結腸擴張外亦有小腸擴張甚至胃、食管擴張。直腸肛門測壓可見有正常反射。病檢腸管變薄，肌細胞退化壞死和肌纖維再生，并可見炎性病灶，神經節細胞和神經叢移位。
(6)其他原因便秘：如①飲食性便秘：乳幼兒可因母乳不足，代乳品過于濃稠或稀少，或未及時添加輔食;年長兒則為食物過少或過精，較少進食富含纖維素的蔬菜和水果所致。②神經性便秘：為中樞神經系統發育缺陷所致，例如大腦發育不全、小頭畸形、腦癱及脊髓拴系癥等。③內分泌性便秘：甲狀腺低功時，因胃腸道蠕動減弱，在新生兒期就可出現腹脹、便秘，并進行性加重。病兒特征為智力障礙、面部臃腫、鼻梁寬平、全身肌肉張力低下。基礎代謝率和血清蛋白結合碘降低可以確診。甲狀腺功能亢進、嗜鉻細胞瘤也可有慢性便秘及結腸擴張。④維生素缺乏：維生素B1缺乏能破壞腸壁中神經節細胞，引起便秘。⑤藥物性便秘：小兒因病長期或大量服用下列藥物可引起慢性便秘：鹽酸哌醋甲酯(中樞興奮藥)、二苯乙內酰脲(苯妥英)、鹽酸丙米嗪(抗抑郁藥)、抗酸劑及含Codein的藥物。
先天性巨結腸的診斷和治療近年來有了很大進步，患兒若能得到早期診斷早期手術治療，術后近期遠期效果較滿意。但高，有些患兒術后大便次數多或失禁，則需較長時間進行排便訓練。
