取感染部位標本，如膿液、痰液、血、尿、皮疹、穿刺物或滲出液等進行細菌培養，根據微生物特性進行鑒定，可確立診斷。綠色膿液和腦脊液等可以先直接涂片或離心后取沉淀涂片染色，如為革蘭陰性菌，則結合臨床表現基本可以明確診斷。培養陽性，并經生化鑒定為假單胞菌可以確診。可在選擇培養基上并產生綠膿色素的即可鑒定為銅綠色假單胞菌，若無色素或在鑒別培養基上不發酵乳糖或葡萄糖的革蘭陰性桿菌，可行以下方法進一步鑒別。
1.色素鑒定 可將細菌接種于King A、King B斜面培養基，37℃ 24h或置室溫觀察5天。
(1)綠膿色素：在King A斜面上呈深綠色，液體培養基接觸空氣處綠色明顯。若色素不明顯或混雜其他色素，可加氯仿于斜面，置室溫觀察1～24h，如仍不明顯，可在氯仿液中滴加稀鹽酸，綠膿色素在酸液層呈紅色。
(2)綠膿熒光色素：銅綠色假單胞菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌在King B斜面培養基上呈現黃綠色熒光。
(3)紅膿色素：在King A斜面培養基上呈紅紫色，如置37℃ 24h紅色不明顯，可再置室溫3～5天觀察。銅綠色假單胞菌產生紅膿毒素者較少見。
(4)黑膿毒素：銅綠色假單胞菌在含蛋白胨培養基中牛長時常有黑膿毒素產生。嗜麥芽窄食單胞菌也有黑膿毒素產生。
2.其他鑒定 銅綠色假單胞菌和其他假單胞菌的主要鑒別是葡萄糖氧化分解、氧化酶、精氨酸雙水解、乙酰胺酶、葡萄糖酸氧化、硝酸鹽還原產氨試驗均為陽性。
銅綠色假單胞菌敗血癥患者尿中出現銅綠色蛋白尿，將患者尿液調成酸性、堿性和中性，置于暗室分別用紫外線照射，如有銅綠蛋白尿則發生淡綠色熒光。
肺炎菌血型X線表現兩側散在支氣管肺炎伴結節狀滲出陰影。
