流式細胞DNA分析

流式細胞DNA分析注意事項

流式細胞儀并非是完全自動化的儀器，準確的實驗結果還需要準確的人工技術配合，所以標本制備需要規范，儀器本身亦需要質量控制。

(一)流式細胞術免疫學檢測的影響因素和質量控制

流式細胞術在免疫學中有著廣泛的應用，其免疫熒光染色的標本制備非常重要，常常由于標本制備過程中出現人為非特異性熒光干擾(尤其在間接免疫熒光染色中)或細胞濃度低等影響檢測結果。解決這些影響因素的方法如下：

(1)確保標本上機檢測前的濃度為1X106細胞/ml，細胞濃度過低直接影響檢測結果。

(2)使用蛋白封閉劑，封閉非特異結合位點，尤其在間接免疫熒光標記時必不可少。常用的蛋白封閉劑為0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。

(3)熒光抗體染色后充分洗滌，注意混勻和離心速度，減少重疊細胞和細胞碎片。

(4)設置對照樣品，采用與抗體來源同型匹配的無關對照和熒光抗體的本底對照。

(5)判定結果時，應注意減去本底熒光，為使免疫熒光的定量分析更精確，應用計算機程序軟件，用擬合曲線方法從實驗組的曲線峰值中減去對照組的曲線峰值，可以得到更準確的免疫熒光定量結果。

(6)注意染色后避光，保證細胞免疫熒光的穩定。

(二)DNA倍體分析的質量控制仍沒有統一的標準，各文獻報道的實驗結果差異較大，1993年10月美國癌癥研究組織制定了FCMDNA測定的統一標準，我們根據這些標準并結合國內有經驗的專家多年的實踐，對FCM的DNA分析技術的質控和注意事項進行說明。

(1)手術切除的新鮮標本或活檢針吸標本取材時，要避免出血壞死組織。

(2)標本采集后要及時固定或深低溫保存，以免組織發生自溶，DNA降解，而造成測試結果的誤差。

(3)固定劑要采用對組織細胞穿透性強的濃度，70%的乙醇固定效果較好。

(4)單細胞懸液制備過程中，注意將待測細胞成分分離出來，減少其他成分的干擾，并注意不要損傷該群細胞。

(5)細胞樣品的采集要保證足夠的細胞濃度，即1X106細胞/ml，雜質、碎片、團塊和重疊細胞應8%，與腫瘤細胞的異質性有關。另外，DNA倍體分析時，同源組織的不同個體會出現10%的漂移。

(4)DNA倍體標準的質量控制，采用相同個體同源正常組織、同樣固定方法、相同的樣品處理方法、相同的染色方法、同步染色、同樣的儀器檢測條件、正常的二倍體組織作為內標準。